沉默MAGI2基因對乳癌耐藥細胞增殖與凋亡影響

2021-08-18 20:52李一黃婷楊麟瀚吳池華
青島大學學報(醫學版) 2021年3期
關鍵詞:細胞增殖細胞凋亡

李一 黃婷 楊麟瀚 吳池華

[摘要] 目的 探討膜相關鳥苷酸激酶轉化蛋白2(MAGI2)對乳癌耐藥細胞增殖、凋亡的影響。

方法 采用熒光定量PCR(qPCR)檢測MAGI2在人乳癌細胞MCF-7與阿霉素耐藥細胞MCF-7/ADR中的表達量。在Lipofectamine 2000介導下將siRNA NC、siRNA MAGI2質粒轉染入MCF-7/ADR細胞。以細胞計數(CCK-8)檢測細胞增殖,流式細胞術實驗檢測凋亡。應用蛋白質印跡法(Western blot)檢測MAGI2、磷脂酰肌醇-3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信號通路相關蛋白表達。

結果 與MCF-7細胞相比,MAGI2在MCF-7/ADR細胞中表達量明顯增加(t=19.902,P<0.05)。si-MAGI2可抑制MCF-7/ADR細胞增殖,促進其凋亡(t=4.027~24.651,P<0.05),降低p-PI3K、p-AKT蛋白水平(t=18.266、19.117,P<0.05)。

結論 MAGI2可能通過調控PI3K/AKT信號通路促進MCF-7/ADR細胞增殖,抑制其凋亡。

[關鍵詞] MAGI2;乳癌耐藥細胞;細胞增殖;細胞凋亡;PI3K/AKT信號通路

[中圖分類號] R737.9;R345.57

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532(2021)03-0369-04

doi:10.11712/jms.2096-5532.2021.57.064

[開放科學(資源服務)標識碼(OSID)]

[網絡出版] https://kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210201.1054.003.html;2021-02-01 15:58:41

EFFECT OF MAGI2 GENE SILENCING ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF DRUG-RESISTANT BREAST CANCER CELLS

LI Yi, HUANG Ting, YANG Linhan, WU Chihua

(Department of Breast Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial Peoples Hospital, Chengdu 610072, China)

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of membrane-associated guanylate kinase 2 (MAGI2) on the proliferation and apoptosis of drug-resistant breast cancer cells.

Methods Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of MAGI2 in human breast cancer MCF-7 cells and adriamycin-resistant MCF-7/ADR cells. The siRNA NC and siRNA MAGI2 plasmids were transfected into MCF-7/ADR cells under the mediation of Lipofectamine 2000. CCK-8 assay was used to observe cell proliferation, and flow cytometry was used to measure cell apoptosis. Western blot was used to measure the protein expression of MAGI2 and the proteins involved in the PI3K/AKT signaling pathway.

Results Compared with MCF-7 cells, MCF-7/ADR cells had a significant increase in the expression of MAGI2 (t=19.902,P<0.05). The si-MAGI2 inhibited the proliferation of MCF-7/ADR cells, promoted the apoptosis of these cells (t=4.027-24.651,P<0.05), and reduced the levels of phosphorylated PI3K and AKT protein (t=18.266,19.117;P<0.05).

Conclusion MAGI2 may promote the proliferation and inhibit the apoptosis of MCF-7/ADR cells by regulating the PI3K/AKT signaling pathway.

[KEY WORDS]MAGI2; breast cancer drug-resistant cells; cell proliferation; cell apoptosis; PI3K/AKT signaling pathway

乳癌是女性腫瘤中死亡率較高的癌癥之一,目前臨床上常采用手術切除、放化療等治療手段,但是仍會出現治療效果不佳、復發等不良情況[1-2]。阿霉素是化療常用的治療藥物之一,在化療過程中容易產生耐藥性,嚴重影響病人的治療效果[3-6]。研究結果顯示,膜相關鳥苷酸激酶轉化蛋白2(MAGI2)可通過結合于第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)從而調控腫瘤細胞增殖、凋亡等[7]。MAGI2被證實在乳癌細胞中發揮重要的調控作用,但對乳癌耐藥細胞的研究相對較少。因此,本實驗通過檢測MAGI2在人乳癌細胞MCF-7及阿霉素耐藥細胞MCF-7/ADR中的表達量,并通過小干擾RNA(siRNA)下調其 MCF-7/ADR細胞中的表達量,觀察其對細胞增殖、凋亡的影響,為提高乳癌耐藥細胞的分子靶向治療效果提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人乳癌細胞MCF-7購自美國模式菌種收集中心,胎牛血清購自美國HyClone公司,DMEM培養基購自美國Gibco公司,Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司,細胞計數試劑盒(CCK-8)購自日本DOJINDO公司;流式細胞術檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司,siRNA NC質粒、siRNA MAGI2質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司,兔抗MAGI2、兔抗磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、兔抗絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)抗體、兔抗磷酸化PI3K(p-PI3K)、兔抗磷酸化AKT(p-AKT)、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自美國Abcam公司。流式細胞儀、酶標儀購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 MCF-7及MCF-7/ADR細胞置于DMEM培養基中孵育,加入體積分數0.10胎牛血清。為維持MCF-7/ADR細胞的耐藥性,額外在培養基中加入75 mg/L阿霉素。培養條件為體積分數0.05 CO2、37 ℃,每2 d更換1次培養基,加入胰蛋白酶按1∶3比例傳代。

1.2.2 細胞轉染 選取對數期的MCF-7/ADR細胞,將其隨機分為si-NC組、si-MAGI2組。si-NC組和si-MAGI2組根據Lipofectamine 2000說明書將siRNA NC質粒和siRNA MAGI2質粒分別轉染入MCF-7/ADR細胞,繼續培養48 h。

1.2.3 qPCR實驗 按照TRIzol試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA,并檢測其濃度和純度,采用逆轉錄試劑盒合成cDNA,最后進行PCR擴增。以GAPDH作為內參照,通過Bio-Rad PCR系統分析MAGI2的表達水平。所用引物及其序列見表1。

1.2.4 CCK-8實驗 收集1×105個MCF-7/ADR細胞,根據1.2.2的方法進行轉染,培養48 h,接種至96孔板,分別培養24、48、72 h,每孔加入10 μL的CCK-8工作液,孵育2~3 h,在酶標儀490 nm波長處檢測吸光度值(A值)。

1.2.5 蛋白質印跡法(Western blot)實驗 收集MCF-7/ADR細胞,加入RIPA裂解液(含10 g/L的PMSF),4 ℃孵育30 min,提取細胞總蛋白,與適量緩沖液混勻,100 ℃變性10 min。吸取20 μg蛋白依次加入上樣孔,通過100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,將目的蛋白轉移至PVDF膜上,放置50 g/L封閉液孵育1 h,將PVDF膜轉移至裝有加入MAGI2抗體(1∶1 000)、PI3K(1∶2 000)、AKT(1∶10 000)、p-PI3K(1∶5 000)、p-AKT(1∶1 000)溶液中,4 ℃過夜,加入二抗(1∶5 000)孵育60 min,顯影、曝光,比較MAGI2和GAPDH蛋白灰度值比值。

1.2.6 流式細胞術實驗 收集MCF-7/ADR細胞,加200 μL 磷脂酰結合蛋白V-FITC/碘化丙啶工作液,37 ℃孵育15 min,流式細胞儀檢測其凋亡率。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析。計量資料結果以±s表示,兩組均數比較采用t檢驗。以P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結? 果

2.1 MAGI2在MCF-7及MCF-7/ADR細胞表達

MAGI2在MCF-7和MCF-7/ADR細胞中的表達量分別為1.000±0.075和2.136±0.118。與MCF-7細胞相比,MAGI2在MCF-7/ADR細胞中的表達量增加,差異具有統計學意義(t=19.902,P<0.05)。見圖1。

2.2 沉默MAGI2對MCF-7/ADR細胞MAGI2蛋白表達和細胞增殖影響

與si-NC組相比,si-MAGI2組MCF-7/ADR細胞中MAGI2蛋白表達量明顯降低,差異有顯著性(t=20.175,P<0.05);si-MAGI2組MCF-7/ADR細胞增殖明顯抑制,差異具有統計學意義(t=2.129~6.167,P<0.05)。見圖2、表2。

2.3 沉默MAGI2對MCF-7/ADR細胞凋亡影響

si-NC組和si-MAGI2組MCF-7/ADR細胞的凋亡率分別為(5.236±0.479)%和(27.423±2.152)%。與si-NC組相比,沉默MAGI2可促進MCF-7/ADR細胞凋亡,差異具有統計學意義(t=24.651,P<0.05)。

2.4 沉默MAGI2對PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達影響

結果顯示,與si-NC組相比,沉默MAGI2對MCF-7/ADR細胞中總PI3K蛋白水平及總AKT蛋白水平均無明顯影響,但可明顯降低p-PI3K蛋白和p-AKT蛋白的表達量,差異具有統計學意義(t=18.266、19.117,P<0.05)。見圖3、表3。

3 討? 論

乳癌是一種女性常見惡性腫瘤[8-9]。化療是一種常用的乳癌治療手段,其中阿霉素是臨床常用的化療藥物[10-11]。MAGI2是膜相關鳥苷酸激酶家族的成員之一,含有1 227個氨基酸殘基,具有多個結構域,能夠與相應的配體結合從而參與細胞的增殖、凋亡等過程。近年來的研究證實,MAGI2參與多種癌癥的發生發展過程。例如,MAGI2在胰腺癌組織中表達量異常,與臨床病理特征如分期、復發等相關[12]。有研究表明,MAGI2可作為miR-487a的靶基因參與乳癌細胞的侵襲、遷移、上皮細胞間充質轉化等過程,在乳癌組織生長以及轉移過程中發揮重要的調控作用[13],這說明MAGI2可以作為乳癌臨床診斷的潛在標志物。本研究結果顯示,MAGI2蛋白在MCF-7/ADR細胞中較MCF-7表達量上調,而下調MAGI2蛋白表達水平可抑制MCF-7/ADR細胞增殖、誘導其凋亡,表明MAGI2可通過促進乳癌細胞增殖并抑制其凋亡,增強其阿霉素耐藥性。

研究表明,MAGI2含有與PTEN蛋白具有高親和力的結構域,通過特異性募集、結合于PTEN,促進PTEN蛋白的穩定性表達[7],PTEN可參與多種腫瘤的發生與發展,例如前列腺癌、口腔癌、乳癌等[14-16]。PTEN主要通過影響PI3K/AKT等信號通路的活性,參與腫瘤細胞的生物學特性[17-20]。研究顯示,PI3K/AKT可以參與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡等[21-22],影響多種腫瘤的病理進展過程,如卵巢癌、結腸癌、乳癌等[23-24],與乳癌、非小細胞肺癌等腫瘤的耐藥性密切相關[25-28]。LI等[25]研究結果顯示,si-HOTAIR通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的表達降低乳癌細胞對阿霉素的抗性。本文研究結果顯示,下調MAGI2對總的PI3K蛋白、AKT蛋白水平均無顯著的影響,但可明顯降低p-PI3K蛋白、p-AKT蛋白水平,表明下調MAGI2可能是通過特異性結合于PTEN,進而影響PI3K/AKT信號通路的活化水平,從而調控乳癌細胞的耐藥性。

綜上所述,MAGI2基因在乳癌阿霉素耐藥細胞MCF-7/ADR中表達量增加;下調MAGI2基因可能通過影響PI3K/AKT信號通路相關蛋白的活性水平,從而抑制耐藥細胞增殖,誘導其凋亡,這為耐藥細胞的分子靶向治療提供理論依據。未來會進一步在多株耐藥細胞系、動物模型以及臨床樣本中進一步探究MAGI2調控乳癌細胞耐藥性的作用以及機制。

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(本文編輯 于國藝)

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